环特研究丨二十五味肺病丸的抗PM2.5作用及其机制

【核心摘要】

探究二十五味肺病丸抗细颗粒物( PM2.5 ) 的作用机制。

方法: 水溶给予不同浓度二十五味肺病丸( 62.5,125,250,500 和1000 μg·mL) 干预，筛选斑马鱼对二十五味肺病丸的耐受浓度。实验中使用纳米活性炭颗粒模拟 PM2.5 进行实验，静脉注射( iv) 纳米活性炭建立斑马鱼巨噬细胞吞噬 PM2.5 功能模型; 肌内注射纳米活性炭建立斑马鱼 PM2.5 分泌进入肠道功能评价模型; 水溶给予尼罗红建立斑马鱼肠蠕动评价模型。二十五味肺病丸干预后，统计斑马鱼体内吞噬纳米活性炭的巨噬细胞数量、巨噬细胞吞噬促进率以及纳米活性炭分泌进入肠道的数量，并进一步探究二十五味肺病丸对斑马鱼肠蠕动功能的影响。选取转基因中性粒细胞荧光斑马鱼，卵黄囊注射脂多糖建立斑马鱼炎症模型，观察并统计斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞个数，以炎症消退率评价二十五味肺病丸的抗炎症作用。

结果: 二十五味肺病丸对斑马鱼的给药浓度为 125 μg·mL ; 二十五味肺病丸可以促进斑马鱼体内巨噬细胞对 PM 的吞噬，并促进 PM 分泌进入肠道，加快肠蠕动，减少斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞的浸润。

结论: 二十五味肺病丸具有显著的抗PM2.5 作用，其作用可能与其促进机体 PM2. 5 的清除及抗炎作用有关。

文｜陈维武 ，周生军，黄燕烽，次旺久美，彭逸 ，陈伦举（西藏奇正藏药股份有限公司，杭州环特生物科技股份有限公司）

国家“重大新药创制”科技重大专项资助项目( 2017ZX09031059)

文章发表于《中国新药杂志》 2019 年第28卷第22期

一、综述

大气污染是目前危害人类健康的重要危险因素。细颗粒物( PM2.5) 是指环境中空气动力学当量直径≤2.5 μm 的颗粒物，其表面可以富集大量的重金属、病毒、细菌、酸性氧化物等有毒物质，可通过机体的呼吸系统吸入肺泡和血液中。

流行病学研究表明，PM2.5颗粒污染与心血管疾病、呼吸系统疾病的发生率密切相关。人暴露在 PM2.5颗粒过量的环境中，可增加机体的氧化应激水平和肺部的慢性炎症反应，增加哮喘、肺癌及动脉粥样硬化等心血管疾病的发病风险。

正常状态下，机体内存在多种途径清除侵入体内的 PM2.5，包括吞噬细胞的吞噬以及黏液-纤毛系统的清除等; 但侵入机体的 PM2.5过量或PM2.5代谢清除异常时，机体内蓄积的PM2.5会进入血液系统或淋巴系统对全身健康产生影响。

由于PM2.5超细颗粒物的成分和粒径复杂，收集大气中的超细颗粒进行研究较为困难，因此研究者多采用纳米活性炭颗粒代替PM2.5超细颗粒物进行研究。

二十五味肺病丸始载于《四部医典》， 全方由红花、檀香、獐牙菜、悬钩木、牛黄、沙棘膏、诃子等25 味药材组成，是传统藏药理论与现代制药技术相结合研发出的新型藏药，对外邪引起的肺 热、肺结核、肺 炎、呼吸急促等热性肺病疗效明显。

目前，对于二十五味肺病丸的研究主要集中在对肺部疾病的治疗作用，而对于防治PM2.5对机体的损害作者尚未见报道。本实验使用斑马鱼诱导多种实验动物模型，纳米活性炭模拟 PM2.5颗粒物，水溶性给予二十五味肺病丸干预，探究二十味肺病丸的抗 PM2.5作用。

二、实验模型与方法：

1. 巨噬细胞吞噬功能评价模型

随机选取 120 尾黑色素等位基因突变型 Albino品系斑马鱼，静脉注射( iv) 给予纳米活性炭建立斑马鱼巨噬细胞吞噬功能评价模型。水溶给予二十五味肺病丸处理 2 d 后，加入中性红溶液对斑马鱼进行活体染色，染色结束后统计吞噬了纳米活性炭的巨噬细胞数量( N) ，以巨噬细胞吞噬促进率来评价二十五味肺病丸对斑马鱼体内巨噬细胞吞噬功能的影响。

2. 肠道功能改善评价模型

随机选取 120 尾黑色素等位基因突变型 Albino品系斑马鱼，肌内注射( im)  给予纳米活性炭建立斑马鱼纳米活性炭分泌进入肠道功能评价模型，水溶给予二十五味肺病丸处理 5 d 后，统计体内纳米活性炭分泌进入肠道的斑马鱼数量( Z) ，评价二十五味肺病丸对纳米活性炭分泌进入肠道功能的影响。

3. 肠道蠕动功能评价模型

随机选取 120 尾野生型 AB 品系斑马鱼，水溶给予尼罗红 16 h 建立斑马鱼肠蠕动评价模型。水溶给予二十五味肺病丸处理 6 h 后，每组随机取 10 尾斑马鱼在荧光显微镜下观察斑马鱼肠腔中荧光染料信号强度、拍照并保存图片，用尼康 NIS-Elements D 3． 10 高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼肠腔荧光染料信号强度( S) 进行定量分析，评价二十五味肺病丸促进肠道蠕动功能。

4. 斑马鱼炎症消退模型

随机选取 120 尾转基因中性粒细胞荧光斑马鱼，分别水溶给予二十五味肺病丸和阳性对照药吲哚美辛。药物处理 1 h 后，卵黄囊注射脂多糖建立斑马鱼炎症模型，然后再分别水溶给予二十五味肺病丸和阳性对照药吲哚美辛干预。药物再处理 2 h 后，分别统计斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞个数( N) ， 以炎症消退率来评价二十五味肺病丸的抗炎症作用。

药物浓度与模型数量: 二十五味肺病丸浓度为13.9，41.7 和 125 μg·mL，吲哚美辛 60 μmol·L，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔( 实验组) 均处理 30 尾斑马鱼，每孔容量为 3 mL。

三、实验结果：

1. 确定斑马鱼对二十五味肺病丸的耐受浓度

二十五味肺病丸 62.5，125 和 250 μg·mL 浓度组斑马鱼均未出现死亡，但 250 μg·mL浓度组斑马鱼出现侧翻，且 500 和 1 000 μg·mL浓度组斑马鱼全部死亡。因此根据实验结果，确定二十五味肺病丸对斑马鱼的给药浓度为 125 μg·mL( 见 表 1) 。

表 1  二十五味肺病丸“浓度-死亡率”原始数据

2. 二十五味肺病丸促进斑马鱼巨噬细胞的吞噬作用

与正常对照组相比，模型对照组斑马鱼吞噬纳米活性炭颗粒个数为 16 个，提示斑马鱼巨噬细胞吞噬功能评价模型造模成功。

二十五味肺病丸浓度为 13.9，41.7 和 125 μg·mL时，斑马鱼吞噬了纳米活性炭的巨噬细胞数量分别为 36，30 和 25个，与模型对照组( 16 个) 比较 P 均 ＜ 0.001，其对斑马鱼巨噬细胞吞噬促进率分别为 125.0% ，87.5%和 56.3% ，提示二十五味肺病丸在 13.9，41.7 和 125 μg·mL浓度时对斑马鱼巨噬细胞吞噬功能都有明显的促进作用( 见图 1 和表 2) 。

图 1   二十五味肺病丸各实验组斑马鱼脑部巨噬细胞吞噬纳米活性炭表型图

黑色区域: 斑马鱼脑部巨噬细胞统计区域; 黄色箭头: 吞噬了纳米活性炭的巨噬细胞， 由于其吞噬了纳米活性炭，颜色比正常的巨噬细胞要深。

表 2   二十五味肺病丸对各实验组斑马鱼巨噬细胞吞噬功能的影响

3. 二十五味肺病丸促进纳米活性炭分泌进入肠道

与正常对照组( 未见纳米活性炭颗粒) 相比，纳米活性炭分泌发生率为 23. 3% ，提示肠道功能改善评价模型造模成功。二十五味肺病丸浓度为13.9和 41.7 μg·mL时，纳米活性炭分泌发生率分别为26. 7% 和 36. 7%,与模型对照组(23. 3%) 比较 P 均＞0. 05,提示二十五味肺病丸在 13. 9 和 41. 7 μg· mL浓度时对斑马鱼纳米活性炭分泌进入肠道没有促进作用。

二十五味肺病丸浓度为 125 μg·mL时，纳米活性炭分泌发生率为 56. 7%,与模型对照组( 23. 3%) 比较P＜0.01,提示二十五味肺病丸在 125 μg·mL浓度时对斑马鱼纳米活性炭分泌进入肠道有明显的促进作用( 见图 2 和表 3) 。

图 2、二十五味肺病丸各实验组斑马鱼肠道分泌纳米活性炭表型图

红色范围: 斑马鱼肠道; 蓝色箭头: 肠道外的纳米活性炭; 黄色箭头: 肠道内的纳米活性炭

4. 二十五味肺病丸促进斑马鱼肠蠕动

水溶给予尼罗红染料 16 h 后，通过荧光显微镜观察发现，模型组斑马鱼肠腔有红色荧光分布，提示斑马鱼肠蠕动评价模型造模成功。

二十五味肺病丸在浓度为 13.9，41.7 和 125 μg·mL时，斑马鱼肠腔荧光强度分别为 641 473，625 366 和 616 768 像素，其肠蠕动促进率分别为 17.4% ，19.4% 和 20.6% ，与模型对照组( 776 340 像素)  比较，13.9 和 41.7 μg· mL浓度组  P ＜ 0.05，125 μg·mL 浓度组  P＜0. 01，提示二十五味肺病丸对斑马鱼肠蠕动有促进作用( 见图 3、图 4 和表 4) 。

图4  二十五味肺病丸各实验组斑马鱼肠蠕动表型图

表4  二十五味肺病丸对各实验组斑马鱼肠蠕动的影响

5.  二十五味肺病丸减轻脂多糖诱导的炎症反应

与正常对照组( 3.6 个)  比较，模型对照组斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞个数为 21.7 个，提示斑马鱼炎症消退模型建立成功。

阳性对照药吲哚美辛 60 μmol·L浓度组斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞个数为 14.2 个，与模型对照组比较 P＜ 0.05，提示吲哚美辛具有抗炎症作用，其炎症消退率为34.6%。

二十五味肺病丸浓度为 13.9 和 41.7 μg·mL时，斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞数量分别为 19.1 和 19.0个，与模型对照组( 21.7 个)  比较 P 均 ＞ 0.05，其对斑马鱼炎症消退率分别为12.0%和12.4%,提示二十五味肺病丸在 13.9 和 41.7 μg·mL浓度时对脂多糖诱发的炎症没有抗炎症作用。二十五味肺病丸浓度为 125 μg·mL时，斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞数量分别为 15.0 个，与模型对照组( 21.7 个) 比较P＜0.05，其对斑马鱼炎症消退率为 30.9% ，提示二十五味肺病丸在 125 μg·mL浓度时可以减轻脂多糖诱发的炎症( 见表 5 和图 5) 。

表 5二十五味肺病丸对斑马鱼脂多糖诱发的炎症反应的影响

图5  二十五味肺病丸各实验组斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞浸润情况

黄色区域: 斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞统计区域

四、讨论

随着大气污染的加剧，PM2.5 已经成为影响人类健康的一大杀手。流行病学调查结果表明，PM2.5 与肺癌、心血管疾病、衰老等疾病的发病率密切相关。PM2.5颗粒空气动力学直径≤2.5 μm，吸入机体后代谢周期长，并能通过外周循环进入各组织器官。PM2.5能增加机体的氧化应激水平，引发级联放大的炎症反应。尽管 PM2.5引发的健康问题形势严峻，但目前临床上还未有以干预 PM2.5为靶点的治疗药物。

二十五味肺病丸是藏医古典巨著《四部医典》中的经典名方，随着近年来科技的进步，越来越多的研究者把目光集中在中国传统藏药名方上。二十五味肺病丸作为临床肺部疾病治疗的一线用药， 对肺炎、肺水肿、肺结核的治疗疗效显著。如果将二十五味肺病丸用于干预 PM2.5 对机体的侵害， “老药新用”将缩短研发时间，有可能为临床用药提供一个安全、可靠的治疗方案。

斑马鱼与人类基因同源性高达 87% ，生物功能和结构与哺乳动物高度相似，具有发育周期短、个头小、实验周期短等优点，因此实验中我们选用斑马鱼作为动物模型。肺泡巨噬细胞主要分布于呼吸道和肺泡表面，是肺部抵御外界污染的屏障，可以吞噬外来的颗粒物和细菌，并通过胞内的溶酶体将其清除，是机体代谢  PM2.5的主要途径之一。

在筛选出斑马鱼对二十五味肺病丸的耐受浓度之后，以纳米活性炭模拟 PM2.5 颗粒，我们发现二十五味肺病丸在 13.9，41. 7 和 125 μg·mL浓度时均能增加斑马鱼巨噬细胞的吞噬功能。

巨噬细胞在识别到 PM2.5 颗粒后，会摄入质膜形成吞噬体，吞噬体与溶酶体结合形成吞噬溶酶体，在溶酶体内的多种水解酶消化分解作用下，PM2.5 颗粒被吸收在细胞质内。二十五味肺病丸可能通过增加巨噬细胞的吞噬作用，促进机体对 PM2.5 颗粒的清除。

吞噬细胞表面存在多种受体可介导其吞噬作用 及胞吞物的专一性，二十五味肺病丸通过何种受体介导巨噬细胞对 PM2.5 颗粒的吞噬是我们下一步研究的重点。肠道是 PM2.5 颗粒物代谢的另一代谢途径之一，PM2.5 的摄入会引起小肠上皮细胞功能紊乱，诱导巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞的募集， 释放大量细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(  tumor nec-rosis factor-α，TNF-α ) 、白介素 1β (  interleukin-1 β， IL-1β)  等，损伤肠道结构、影响肠道功能。肠蠕动功能是消化道主要的功能之一，改善肠蠕动功 能，可以增加消化道的消化吸收能力，促进消化液的分泌。

我们发现二十五味肺病丸在 125 μg· mL浓度时对斑马鱼纳米活性炭分泌进入肠道有明显的促进作用，13.9，41.7 和 125 μg·mL3个浓度时均能改善斑马鱼的肠道功能，促进斑马鱼肠蠕动，增加 PM2.5的外排，进一步提示二十五味肺病丸可以加速机体代谢 PM2.5 的作用。

PM2.5 除了可以引发肺部的炎症反应外，还可以通过募集免疫细胞影响其他组织器官的炎症水平。

脂多糖诱导是模拟炎症反应发生的经典模型，实验中我们发现，二十五味肺病丸浓度为 125 μg·mL时，斑马鱼卵黄囊内中性粒细胞数量分别为 15.0 个，与模型对照组 ( 21.7 个)  比较  P＜ 0.05，提示二十五味肺病丸在 125 μg·mL浓度时对脂多糖诱发的炎症有抗炎症作用。

以上实验结果表明，二十五味肺病丸在 125μg·mL浓度时能促进巨噬细胞对 PM2.5的吞噬清除，加速其分泌到肠道，改善肠道功能、促进其外排。与此同时减少 PM2.5诱导的免疫细胞的募集和炎症反应的发生，减少 PM2.5 对机体的损害。

二十五味肺病丸作为临床一线用药，主要治疗肺病引起的咳嗽、胸胁痛、发烧等，目前针对其抗PM2.5 的研究相对较少。如何将该药已有的临床用药经验与新适应证研究相结合是下一步研究方向。本实验中二十五味肺 病丸的药效学评价主要在斑马鱼模型上完成，存在一定的局限性，未来还需要在哺乳动物模型和临床试验中对疗效和安全性做进一步验证。

参考资料：

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