斑马鱼研究丨甘油葡糖苷的护肤功效评价

近期，环特生物在期刊《广东化工》上发表题为 《甘油葡糖苷的护肤功效评价》的最新研究成果。该项目利用斑马鱼技术探究甘油葡糖苷的护肤功效。

实验过程中，用氯化钠溶液处理斑马鱼，使其皮肤表面失水皱缩，建立补水保湿模型；将斑马鱼尾鳍进行手术切断处理，建立修复模型；利用 SLS（十二烷基磺酸钠）刺激诱导斑马鱼产生皮肤表面炎症反应，建立舒缓功效模型；通过斑马鱼节间血管直径的扩张程度以及血流速度评价甘油葡糖苷促进微循环的功效。

该研究基于斑马鱼实验发现，甘油葡糖苷能增大斑马鱼尾部面积，促进尾鳍再生，减少皮肤表面中性粒细胞的浸润，增大血管直径并加速血流。实验结果表明，甘油葡糖苷具有补水保湿、修复、舒缓及改善微循环作用，为甘油葡糖苷的相关功效研究提供了参考依据。

● 综述

甘油葡糖苷 αGG，别名为格莱可因，是一种淡黄色液体，易溶于水，其由一分子葡萄糖和甘油通过α-1，2-糖苷键连接而成。甘油葡糖苷是来源于沙漠卷柏或耐盐蓝藻的一种纯天然小分子物质，它可以保护细胞免受高温、高渗、干旱和紫外线等恶劣环境的破坏。在日本清酒、味增和米醂中，也发现含有活性成分 aGG。

目前合成 αGG 的方法主要有化学合成、蔗糖磷酸化酶催化合成以及通过由盐胁迫处理寡养单胞菌或蓝藻等微生物合成。虽然现阶段已有多种 αGG 的合成方式，但是已报道的 αGG 产物分离方法还比较少；奥地利格拉茨工业大学的 GOEDL 等通过混合活性炭与硅藻土为分离介质从酶反应体系中吸附-洗脱获得了较高纯度的 aGG。

甘油葡糖苷分子结构与理化性质独特，具有低吸水性、高保湿性的特点，因此可作为化妆品原料，以提高皮肤的保湿、抗衰老等效果。有研究表明甘油葡糖苷对于羟基自由基、DPPH 自由基及超氧阴离子自由基具有清除能力。

此外，有研究通过建立一些酶保护模型证实 αGG 可以作为蛋白稳定剂使用，能够在高温或冷冻干燥条件下稳定蛋白质等生物大分子的结构。在保健方面，αGG 能促进益生菌生长，增强肠道耐受性。在治疗过敏性呼吸系统疾病、保护眼角结膜、降低血糖等方面，αGG 也发挥了应用价值。

目前关于甘油葡糖苷的功效评价方法主要有体外细胞生物法、生物化学法、人体功效评价法等，但以斑马鱼为试验对象的甘油葡糖苷功效评价未见文献报道。

斑马鱼是一种热带淡水鱼，因其与人类具有较高的基因同源性、皮肤结构相似性、免疫功能的相似性等特点而被广泛应用于药品、保健食品及化妆品的替代试验，同时，斑马鱼试验方法具有可靠性高、试验周期短、成本低等优点，因而是功效评价良好的初筛方法，目前已有大量功效研究方法采用斑马鱼技术。本文旨在利用斑马鱼诱导多种试验模型，水溶性给予甘油葡糖苷进行干预，探究甘油葡糖苷补水保湿、修复、舒缓及改善微循环的护肤功效。

● 实验部分

1.1 补水保湿功效评价模型

斑马鱼皮肤结构与人皮肤结构相似，具有表皮层、真皮层和皮下组织。有文献资料表明，斑马鱼表皮具有一定的渗透压耐受范围，超过耐受范围将产生脱水现象，因此使用高渗透溶液可以建立斑马鱼补水保湿的诱导模型。

用 0.9%氯化钠溶液处理斑马鱼，建立补水保湿模型，水溶给予不同浓度的甘油葡糖苷（0.5，1.0 和 2.0 mg.mL-1），28℃培养箱孵育 18h 后，以斑马鱼尾部面积评价甘油葡糖苷的补水保湿功效。同时设置空白对照组和模型对照组。

1.2 修复功效评价模型

斑马鱼尾鳍是研究皮肤组织再生的常用实验模型，将尾鳍进行机械损伤后，比较空白组与受试物组的尾鳍再生程度可以用于评价受试物的修复功效，目前已有大量研究采用该实验方法。

采用手术切断尾鳍的方法建立斑马鱼修复模型。水溶给予不同浓度的甘油葡糖苷（0.5，1.0 和 2.0 mg.mL-1），28℃培养箱孵育 2d 后，以斑马鱼尾鳍面积评价甘油葡糖苷的修复功效。同时设置空白对照组和模型对照组。

1.3 舒缓功效评价模型

舒缓，一般是指能改善皮肤刺激等状态的功效作用。皮肤刺激性所表现出来的皮肤灼热、红肿等表观现象通常是皮肤早期炎症反应发生的结果，因此可以通过炎症反应的抑制作用反应舒缓功效。斑马鱼与人类具有相似的免疫应答系统，炎症反应的发生将导致免疫细胞的迁移和聚集，选用转基因中性粒细胞绿色荧光品系斑马鱼可以实时观察中性粒细胞的迁移和聚集情况，从而以计数的方式评价受试物的舒缓功效。

建立斑马鱼皮肤舒缓模型，水溶给予 1.0 mg.mL-1 甘油葡糖苷，处理 18 h 后，在荧光显微镜下拍照，以皮肤表面中性粒细胞数量的统计学分析结果评价甘油葡糖苷的舒缓功效。同时设置空白对照组和模型对照组。

1.4 改善微循环功效评价模型

皮肤微循环的活体观察是早期微循环研究最经常采用的方法之一，如李慧良等应用该技术对小鼠皮肤侧面微循环的研究从而评价天然提取物的抗皮肤衰老作用。但由于技术条件要求较高，组织标本制备周期较长等原因，其应用受到一定的限制，参照上述方法，应用斑马鱼技术可以实现简单、快速的改善微循环评价试验。

水溶给予不同浓度的甘油葡糖苷（1.0 和 2.0 mg.mL-1），处理 24 h 后，统计节间血管直径，根据节间血管直径的统计学分析结果评价甘油葡糖苷对斑马鱼的节间血管直径改善功效。

此外，利用血流分析仪检测受试斑马鱼的节间血流速度，补充评价改善微循环功效。

● 实验结果

1. 甘油葡糖苷促进补水保湿功效

与空白对照组相比，模型对照组斑马鱼尾部面积明显较少，提示斑马鱼补水保湿功效评价模型造模成功。甘油葡糖苷的浓度为 0.5，1.0 和 2.0 mg·mL-1 时，与模型对照组(167353 像素)比较，P < 0.001，对斑马鱼尾部的补水保湿功效分别为 91%，70%和128%。 (见图 1 和表 1) 。

2. 甘油葡糖苷促进修复功效

与空白对照组相比，模型对照组斑马鱼尾鳍面积明显较少，提示斑马鱼修复功效评价模型造模成功。甘油葡糖苷的浓度为0.5，1.0和2.0mg·mL-1时，与模型对照组比较，P<0.05，修复功效分别为20%，23%和37%( 见图1和表2) 。

3 舒缓功效

与空白对照组相比，模型对照组斑马鱼皮肤表面中性粒细胞数量明显增多，提示斑马鱼舒缓模型建立成功。甘油葡糖苷浓度为1mg·mL-1时，斑马鱼皮肤表面中性粒细胞数量与模型对照组比较P<0.01，其对斑马鱼炎症消退率为58% (见图3和表3)。

4 改善微循环功效

甘油葡糖苷的浓度为1.0 和 2.0 mg·mL-1时，斑马鱼节间血管直径分别为 8.36 和 8.86μm 与空白对照组比较，P均< 0.01，其改善微循环的功效分别为 8%和 14%。甘油葡糖苷的浓度为1.0mg·mL-1和 2.0mg·mL-1时，斑马鱼节间血液流速分别为454 μm/s和 499 μm/s，与空白对照组比较，P< 0.05，其改善微循环的功效分别为31%和44%。 (见图4，图5和表4，表5) 。

● 讨论

在新的法规要求和产品发展需求下，化妆品及其原料的安全性和功效性评价显得越来越重要，各种不同机理的检测评价方法和模型不断涌现。

斑马鱼由于其与人类基因的高同源性、生物功能和结构的高度相似等优势，已成为国际第三大模式生物，斑马鱼试验的测评结果逐渐成为人体实验前的良好初筛方法。本文的试验结果显示，甘油葡糖苷的试验浓度为0.5，1.0和 2.0mg·mL-1时，具有补水保湿功效；试验浓度为0.5，1.0 和 2.0mg·mL-1 时，具有修复功效；试验浓度为1mg·mL-1时，具有舒缓功效；试验浓度为1.0和 2.0mg·mL-1时，具有改善微循环功效。

本文的研究工作可以为甘油葡糖苷在补水保湿、修复、舒缓、改善微循环等方面的功效提供参考依据。