论文解读丨影响因子9.038！环特合作伙伴温州医科大学陈将飞团队发表高分学术论文！

编者按

汽车工业化过程给人类带来交通便利的同时也产生了很多环境不友好问题，其中轮胎磨损颗粒不仅是微纳米塑料污染的重要来源，而且轮胎抗臭氧剂6PPD也会随之进入环境产生危害作用。最新的研究表明，6PPD在地表的臭氧衍生物6PPDQ，是困扰科学界多年的银鲑三文鱼城市径流死亡综合征的罪魁祸首。然而，目前针对6PPD和6PPDQ的环境生态影响研究还很欠缺。

为了探究此类污染物对鱼类的生物毒性及机制，环特生物长期合作的浙江省模式生物技术与应用重点实验室、温州医科大学的陈将飞副研究员团队在国际权威期刊《Journal of Hazardous Materials》上发表了题为“6PPD and its metabolite 6PPDQ induce different developmental toxicities and phenotypes in embryonic zebrafish”的研究论文（IF＝9.038），研究了6PPD或6PPDQ对斑马鱼胚胎发育毒性的特征及分子响应，为探明6PPD和6PPDQ对鱼类的不同毒性机制提供了重要生物学依据。本期，我们一起来解读本篇文章——

原文献：Shu-Yun Zhang #, Xiufeng Gan#, Baoguo She#, Jian Jiang, Huimin Shen, Yuhang Lei, Qiuju Liang, Chenglian Bai, Changjiang Huang, Wencan Wu, Ying Guo*, Yang Song*, Jiangfei Chen*. 6PPD and its metabolite 6PPDQ induce different developmental toxicities and phenotypes in embryonic zebrafish. J Hazard Mater. 2023, 455: 131601.

原文连接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37182464/

一、研究背景：

当前，N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基对苯二胺 (6PPD) 已被广泛用作汽车轮胎抗氧化剂，以防止硬化和弯曲开裂。目前，全球每年生产和使用23亿个轮胎，加上每年行驶数万亿英里，导致含有轮胎抗臭氧剂6PPD的磨损颗粒对环境造成严重污染。每单位质量轮胎中 6PPD 的比例约为0.4%−2%，并且6PPD在地表的臭氧衍生物6PPDQ的产量为6PPD的1%至75%。6PPD和6PPDQ均通过地表水径流大量排放到河流和海洋中，浓度范围为0.6至19μg/L。

在全球范围内，6PPD和6PPDQ的平均浓度分别为0.21-2.71μg/L和0.21-2.43μg/L，空气中颗粒物的浓度分别为0.82–6.3 pg/m³和0.54–13.8pg/m³，路边土壤中的浓度分别为31.4–831ng/g和9.5–936ng/g。在道路灰尘、地下停车场和汽车中检测到的6PPD含量为4.1–429ng/g，6PPDQ含量为3–227ng/g。此外，在生菜作物上检测到的6PPD和6PPDQ浓度为0.75μg/g。从不同环境中普遍检测到6PPD和6PPDQ，橡胶磨损污染已引起全世界的高度关注，应系统研究其潜在危害。

最近的研究表明，6PPDQ 是近几十年来北美西海岸几个城市频繁发生的大麻哈鱼神秘死亡的原因。此外，据报道，城市径流对银鲑鱼、硬头鲑鱼和奇努克鲑鱼幼鱼是致命的，但对同属红鲑鱼则不会致命。暴露于合成的6PPDQ或轮胎渗滤液衍生的6PPDQ (∼20µg/L) 可在5小时内导致快速死亡。幼年鲑鱼急性暴露于道路径流时的死亡率，与脑血管破坏有关。6PPDQ对测试的13种鲑鱼中的4种具有高毒性。6PPDQ急性暴露对四种淡水鱼类和甲壳类动物没有致命性。他们还发现，在4个受试物种中，有3个物种的6PPD毒性高于6PPDQ。6PPD和6PPDQ 均具有物种特异性毒性。因此，识别6PPD和6PPDQ特异性暴露生物标志物和信号通路，可以帮助我们了解它们对鱼类和人类的潜在危害，并为它们在轮胎制造中的持续使用提供信息。

斑马鱼作为环境危害的生物传感器，与哺乳动物有许多相同的发育、细胞、信号传导和生理特征。此外，胚胎斑马鱼对外部环境污染高度敏感，已被用于鉴定对6PPD或6PPDQ暴露的发育、基因表达和神经行为反应。在本研究中，为了表征6PPD和6PPDQ诱导的不同发育毒性反应，将斑马鱼胚胎广泛暴露于各种浓度的6PPD和6PPDQ，浓度范围从环境相关浓度 (0.025mg/L) 到致畸浓度（1.2mg/L）。

图1：6PPD和6PPDQ诱导斑马鱼胚胎不同毒性摘要图

此外，当前工作中使用的剂量与之前文献中使用的剂量数量级相同。尽管最高浓度范围很大，但它可以帮助识别体内的不利影响，以评估其对水生鱼类甚至人类的健康风险。血管系统、中性粒细胞和肠神经元的转基因荧光报告系用于追踪器官发育和功能。另外，还进行了mRNA-Seq和定量实时PCR (qRT-PCR) 测定，以识别和确认因发育暴露于6PPD和6PPDQ而导致的差异基因表达。

二、研究成果：

1. 6PPD暴露诱导斑马鱼轴性近视眼毒性（图2），6PPD暴露特异引起幼鱼眼轴拉长和巩膜直径增加的轴性近视样表型，具有眼球凸出和眼内血管融合的特征。

图2：6PPD暴露诱导斑马鱼轴性近视眼毒性

2. 6PPDQ胚胎期暴露诱导斑马鱼肠道发育畸变（图3），6PPDQ暴露特异引起幼鱼肠道面积增大、血红细胞堆积、以及肠道区域嗜中性粒细胞和肠道神经元的过表达。

图3：6PPDQ胚胎期暴露诱导斑马鱼肠道发育畸变

3. mRNA-Seq分析6PPD和6PPDQ引起的全基因表达差异（图4），mRNA-Seq分析发现6PPD和6PPDQ暴露幼鱼的差异表达基因与其毒性特征相一致。其中，6PPD激活了视黄酸（RA）代谢特异基因cyp26a1，而6PPDQ却激活了对外源刺激应激的细胞内基因cyp1a。

图4：mRNA-Seq分析6PPD和6PPDQ引起的全基因表达差异

4. 6PPD和6PPDQ引起不同特征基因和信号通路富集（图5），6PPD主要抑制RA代谢、光传导、光感受器功能和视觉感知的基因表达，而6PPBD则主要干扰参与内向K+流和电压门控离子通道活性、K+跨质膜导入、铁离子结合和产生IgA的肠道免疫网络基因。

图5：6PPD和6PPDQ引起不同特征基因和信号通路富集

三、结论：

本研究探讨了6PPD和6PPDQ对斑马鱼胚胎发育的毒性机制。这两种化合物均不会引起显著的死亡率，但显著降低了胚胎的自发运动和心率。两种化合物都会诱发具有不同表型的畸形；暴露于6PPD的幼鱼表现出类似近视的表型，眼球凸起，血管融合，而暴露于6PPDQ的胚胎斑马鱼则表现出肠道增大和血液凝固、中性粒细胞被激活和肠神经元过表达。

mRNA-Seq和定量实时PCR测定表明，6PPD和6PPDQ诱导了与其毒性表型一致的不同的基因表达。6PPD激活了视黄酸代谢基因cyp26a，而6PPDQ激活了对外源性物质基因cyp1a的适应性细胞反应。6PPD抑制眼睛中与视黄酸代谢、光转导、光感受器功能和视觉感知有关的基因表达。相反，6PPDQ干扰了参与内向整流K+和电压门控离子通道活性、K+通过质膜导入、铁离子结合和IgA产生的肠道免疫网络的基因。目前的研究促进了对许多鱼类物种受到 6PPD和6PPDQ不利影响相关原因的探究。

该论文第一作者为张淑芸研究员、甘秀凤硕士研究生和沈宝国博士后。陈将飞副研究员为论文最后通讯作者，中科院生态环境研究中心宋杨教授和暨南大学郭英教授为联合通讯作者。陈将飞副研究员长期从事以斑马鱼为模式生物的环境毒理学研究，有多次海外访问学习与交流的研究经历，具有扎实的毒理学和分子生物研究基础。截止日前，陈将飞副研究员已发表学术论文41篇，SCI引用次数1400余次（单篇引用超过50次10篇），第一/通讯作者论文24篇。

参考文献

[1] Cao, G., Wang, W., Zhang, J., Wu, P., Zhao, X., Yang, Z., et al., 2022. New evidence of rubber-derived quinones in water, air, and soil. Environ Sci Technol 56 (7),4142–4150.

[2]Tian, Z., Zhao, H., Peter, K.T., Gonzalez, M., Wetzel, J., Wu, C., et al., 2021.A ubiquitous tire rubber–derived chemical induces acute mortality in coho salmon. Science 371, 185.

[3] Johannessen, C., Helm, P., Metcalfe, C.D., 2021. Detection of selected tire wear compounds in urban receiving waters. Environ Pollut 287, 117659.

[4] Seiwert, B., Kl¨ockner,P., Wagner, S., Reemtsma, T., 2020. Source-related smart suspect screening in the aqueous environment: search for tire-derived persistent and mobile trace organic contaminants in surface waters. Anal Bioanal Chem 412,4909.

[5] Huang, W., Shi, Y., Huang, J., Deng, C., Tang, S., Liu, X., et al., 2021. Occurrence of substituted p-phenylenediamine antioxidants in dusts. Environ Sci Technol Lett 8(5), 381.

[6] Castan, S., Sherman, A., Peng, R., Zumstein, M.T., Wanek, W., Hüffer, T., et al.,2023. Uptake, metabolism, and accumulation of tire wear particle-derived compounds in lettuce. Environ Sci Technol 57 (1), 168–178.

[7] Xu, J., Hao, Y., Yang, Z., Li, W., Xie, W., Huang, Y., et al., 2022. Rubber antioxidants and their transformation products: environmental occurrence and potential impact. Int J Environ Res Public Health 19 (21).

[8] French, B.F., Baldwin, D.H., Cameron, J., Prat, J., King, K., Davis, J.W., et al., 2022.Urban roadway runoff is lethal to Juvenile Coho, Steelhead, and Chinook Salmonids, but not Congeneric Sockeye. Environ Sci Technol Lett 9 (9), 733–738.

[9] Blair, S.I., Barlow, C.H., McIntyre, J.K., 2021. Acute cerebrovascular effects in juvenile coho salmon exposed to roadway runoff. Can J Fish Aquat Sci 78 (2),103–109.

[10] Brinkmann, M., Montgomery, D., Selinger, S., Miller, J.G.P., Stock, E., Alcaraz, A.J., et al., 2022. Acute toxicity of the tire rubber-derived chemical 6PPD-Quinone to four fishes of commercial, cultural, and ecological importance. Environ Sci Technol Lett 9 (4), 333.

[11] Foldvik, A., Kryuchkov, F., Sandodden, R., Uhlig, S., 2022. Acute toxicity testing of the tire rubber-derived chemical 6PPD-quinone on Atlantic Salmon (Salmo salar) and Brown Trout (Salmo trutta). Environ Toxicol Chem 41 (12), 3041–3045.

[12] Hiki, K., Asahina, K., Kato, K., Yamagishi, T., Omagari, R., Iwasaki, Y., et al., 2021. Acute toxicity of a tire rubber-derived chemical, 6PPD quinone, to freshwater fish and crustacean species. Environ Sci Technol Lett 8 (9), 779.