斑马鱼研究丨香菇多糖可能通过破坏葡萄糖和脂质代谢而损害斑马鱼胚胎的早期发育

作者：缪文钰，何玲玲，张涛，李春启

作者单位：浙江大学医学院公共卫生学院，杭州环特生物科技股份有限公司

本文发表于：《Processes》2022 年1月第10卷第120期

特别说明：本项目受浙江省教育厅科研基金（Y201940954）资助

核心摘要 ：LNT是从香菇（L. edodes）中提取的主要生物活性物质。尽管功能和药理学研究已经表明，LNT对动物和人类具有多重益处，但安全性评价还远远不够。为了评价潜在的安全风险，将斑马鱼胚胎持续暴露于不同浓度的LNT中120小时。LNT的96hLC50测定为1228 μg/mL，观察到体长短、眼睛和鱼鳔尺寸减小、卵黄囊水肿等形态缺陷。此外，LNT暴露显著降低了斑马鱼胚胎的血流速度和运动活动。生化参数也受到影响，显示斑马鱼胚胎在暴露于 LNT 后，葡萄糖、甘油三酯和胆固醇水平降低。相应地，参与糖脂代谢的基因表达也受到影响。综上所述，本研究证实了高浓度LNT对斑马鱼幼鱼早期发育的不利影响。

● 综述

香菇多糖（LNT）是一种中性β-葡聚糖，由重复的β-（1,6）支链β-（1,3）-葡聚糖单元组成，是从香菇（L. edodes ）中提取的主要生物活性化合物。LNT 和其他 β-葡聚糖的有益作用已被人们利用现代药理和生物学策略进行了广泛的研究，揭示了β-葡聚糖具有多种功能。

日本的研究人员在1970年代证明了 LNT 的抗肿瘤活性，进一步发现了其他有益生物活性，包括抗氧化活性、抗菌活性、抗病毒活性、抗炎活性、肾脏保护活性，重要的是免疫调节活性。有趣的是，β-葡聚糖的生物活性已在脊椎动物（如人类、鸡、狗和鱼）和无脊椎动物（如虾和果蝇）中得到证实。

由于其功能和味道，β-葡聚糖被广泛用作药物、抗菌剂、膳食补充剂和营养增强剂。例如，两种 β-葡聚糖 LNT 和 krestin 在日本已被批准作为胃癌治疗的抗肿瘤药物，并进行了广泛地研究以阐明 LNT 抗肿瘤活性的潜在机制，已确定了两种主要机制：（1）增强对肿瘤的免疫力，包括细胞和体液免疫；(2) 通过直接诱导细胞凋亡和死亡来防止癌细胞增殖或转移。

除了在癌症治疗中的应用外，LNT 已被欧盟批准为一种安全的食品成分，并用于各种产品，如膳食补充剂、加工食品和饮料等。在动物和人类中进行的功效及研究部分验证了LNT的安全性，但仅提供了有限的价值。

在小鼠（静脉内）和大鼠（腹膜内、皮下和口服）中，LNT的LD50值分别确定为250–500mg/kg和>2500mg/kg 。在一项为期 6 个月的研究中，将不同剂量的 LNT（0.01、0.1、1、10mg/kg/天）静脉注射到大鼠尾静脉，以评估LNT的慢性毒性。所有治疗组均出现不同程度的动脉炎、肺出血和生精不足，无影响水平低于0.01mg/kg/天。基于这一结果，并考虑到对癌细胞的直接细胞毒性和抗菌作用，LNT可能对受体产生不利影响。因此，应在不同物种中充分评估 LNT 的健康风险，并阐明其潜在机制。

在用于人体之前，药物、食品成分或化学品的安全性评价是必不可少的。目前，大多数毒性试验都使用动物，尤其是啮齿动物。为了改善动物福利，鼓励采用符合 3R 原则（替代、减少和改进）的测试方法。斑马鱼作为安全评估中的替代动物模型越来越受欢迎，因为它们具有遵守 3R 原则的特殊优势。例如，与啮齿动物相比，斑马鱼是低感知力的脊椎动物，这意味着实验期间的痛苦程度较低。使用斑马鱼进行早期筛查可以在随后的研究阶段大大减少啮齿动物的数量。

此外，斑马鱼的繁殖力强，胚胎在体外易于处理，显著提高了实验效率。斑马鱼胚胎作为一种用于发育生物学的重要模型生物，由于它的透明性可以在光学显微镜下进行观察，因此，很多研究使用斑马鱼胚胎来评估化学品的发育毒性。更重要的是，通过对斑马鱼的基因组进行测序，已经能够在分子水平上阐明毒性表型的潜在机制。

在本研究中，胚胎斑马鱼被用来研究高浓度LNT对生命早期发育过程的影响。测定受精后72和96小时的孵化率 (hpf) 和 96 hpf 的中位致死浓度 (LC50)。此外，在120hpf下研究了持续暴露于不同浓度LNT的斑马鱼胚胎的形态变化、心跳、血流速度和运动活性。此外，还对反映能量代谢的生化指标进行了评价。为了揭示潜在的机制，参与葡萄糖和脂质代谢的基因在转录水平上进行了量化。本研究使用胚胎斑马鱼评估了 LNT 的潜在不利影响。

● 实验结果

1. LNT 对斑马鱼胚胎的致死作用及发育毒性

为了研究LNT的致死效应，将受精卵暴露于一系列浓度的LNT中96 小时。通过分析图1A所示的拟合曲线，确定LNT的96h的LC50值为1228 μg/mL。

图 1. LNT 对斑马鱼胚胎的致死效应和发育毒性。( A ) 96 h 的LC50 的拟合曲线（每组n = 30，3次生物学重复）；( B ) 72 和 96 hpf 的孵化率（每组n = 30，3次生物学重复）；( C ) 120 hpf 的胚胎代表性图像；( D ) 120 hpf 时胚胎体长 (每组n = 20); ( E ) 120 hpf 时胚胎的心跳 (每组n = 10); ( F ) 120 hpf 时胚胎的血流速度 (每组n = 10)。所有数据均与对照组比较，*，p < 0.05；**, p< 0.01; ***，p < 0.001。

根据LC50值，设定浓度为30、100、300和900 μg/mL（分别为 1/36、1/12、1/4 和 3/4 LC50）的LNT用于进一步评估。如图 1B所示，72小时和96小时的孵化率不受 LNT 处理的影响，即使在 900 μg/mL 组中也是如此。除卵黄囊水肿外，所有 LNT 治疗组均未观察到明显畸形（图1C ）。然而，斑马鱼胚胎的体长以剂量依赖性方式显著减少（图1D），表明LNT暴露抑制了个体的生长。有趣的是，所有LNT暴露组的血流速度均显著降低，对20秒内的心跳没有任何影响（图1E、F）。

2、LNT 诱导斑马鱼胚胎的病理改变

为了进一步评估LNT暴露对斑马鱼胚胎发育的不利影响，量化更详细的特征，包括眼睛和鱼鳔大小以及卵黄囊面积（图2A）。在对照组中观察到膨胀的鱼鳔（图2A ，蓝色虚线），而在 LNT 治疗组中鱼鳔的大小呈剂量依赖性减小（图2B ）。值得注意的是，在 900 μg/mL 组中，几乎 50% 的斑马鱼胚胎完全失去了膨胀的鱼鳔。

此外，900μg/mL组的眼睛（图2A，红色虚线）明显小于对照组（图2C）。观察到的另一个明显畸形是卵黄囊水肿。如图2D所示，卵黄囊面积随着 LNT 浓度的增加而明显增加。所有这些形态学变化，包括体长、眼睛和鱼鳔大小以及卵黄囊面积，都表明高浓度的LNT抑制了斑马鱼胚胎的正常发育。

图2. LNT诱导的斑马鱼胚胎病理改变。（A）胚胎在 120 hpf 时的代表性图像（红色虚线：眼睛；蓝色虚线：鱼鳔；黄色虚线：卵黄囊）；( B )相对鳔面积；( c ) 相对眼区；( D ) 相对卵黄囊面积。每组n =20。所有数据与对照组比较，*，p <0.05；***，p < 0.001。

3、LNT 暴露对斑马鱼胚胎运动活动的影响

LNT 对斑马鱼胚胎运动活动的影响如图3所示。在对照组和所有 LNT 治疗组中观察到明暗节律（图3A），表明LNT暴露不会破坏斑马鱼胚胎对明暗刺激的反应。然而，LNT 处理组斑马鱼胚胎在明暗阶段移动的总距离显著减少（图3B，C）。

图3. LNT 暴露对斑马鱼胚胎运动活动的影响。( A ) 斑马鱼胚胎在 25 分钟内移动的总距离；( B ) 暗循环中斑马鱼胚胎在一分钟内移动的距离；( C ) 斑马鱼胚胎在光照周期内一分钟内移动的距离。每组n = 12。所有数据与对照组比较，**，p < 0.01；***，p < 0.001。

4、LNT 暴露对斑马鱼胚胎 Glu、TG 和 T-CHO 水平的影响

图4. LNT暴露对斑马鱼胚胎Glu、TG和T-CHO水平的影响。(A)TG含量；（B）T-CHO含量，（C）GLU含量。每组n = 4。所有数据与对照组比较，*，p < 0.05；**, p < 0.01; ***，p < 0.001。

5、LNT 暴露对斑马鱼胚胎葡萄糖、脂质和胆固醇代谢相关基因的影响

为了阐明 LNT 诱导的葡萄糖、甘油三酯和胆固醇降低的机制，使用 qRT-PCR 对参与这些物质代谢的基因的 mRNA 水平进行了量化。图 5A的结果表明，在用300和900 μg/mL的LNT处理后，己糖激酶 (HK1) 的表达显著增加。相反，30、300和900μg/mL组的丙酮酸激酶（PK）mRNA水平低于对照组。

此外，细胞溶质磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 (PEPCK-C) 的转录水平在 900 μg/mL 组中显著降低。这些结果表明，LNT 暴露影响了与葡萄糖代谢相关的基因。

图5. LNT 对斑马鱼胚胎代谢相关基因 mRNA 水平的影响。(A)与糖代谢相关的基因；( B ) 与脂质代谢相关的基因；(C)与胆固醇代谢有关的基因。每组n = 6。所有数据与对照组比较，*，p < 0.05；**, p < 0.01; ***，p < 0.001。

此外，参与脂质代谢过程的基因的转录水平也被 LNT 暴露破坏。过氧化物酶体增殖物激活受体-α (PPAR-α)、甾醇调节元件结合蛋白 1α (SREBP1α)、脂肪酸合酶 (FAS)、酰基氧化酶 (ACO) 和载脂蛋白 A-IV (Apo) 的 mRNA 水平分别为用 900 μg/mL LNT 处理后下调（图5B ）。脂肪酸结合蛋白 6 (FABP6) 的 mRNA 水平在 300 和 900 μg/mL 组中均下降。然而，肉碱棕榈酰转移酶 1 (CPT1) 的转录被 300 和 900 μg/mL 的 LNT 诱导（图5B ）。

之后，量化了与胆固醇代谢相关的基因羟甲基戊二酰辅酶 A 还原酶 a (HMGCRa)、HMGCRb、低密度脂蛋白受体 (LDLR) 和胆固醇 7α-羟化酶 (CYP7A1)。结果显示，900μg/mLLNT显著抑制LDLR和CYP7A1的表达（图5C ）。HMGCRa 和 HMGCRb 不受 LNT 的影响。

● 结论

LNT 暴露对斑马鱼胚胎有毒性作用。在本研究中，96小时LC50 值估计为1228μg/mL。浓度为30、100、300和900μg/mL的LNT不会改变胚胎在 72 和 96hpf时的孵化率。然而，胚胎的发育会受到损害，表现为体长缩短、血流速度减慢、眼睛和鱼鳔小、卵黄囊水肿。

此外，LNT也会抑制运动活性。对生化指标和基因转录的检测表明，LNT 显著破坏了葡萄糖、脂质和胆固醇的代谢，这可能导致LNT引起的能量缺乏。

所有这些结果表明，高浓度的LNT会在斑马鱼胚胎中诱导发育毒性，这可能是由于LNT诱导的能量代谢中断所致。