当基因编辑进入原料研发：在国妆时代的β，成就王牌抗衰单品的α！｜环特化妆品临床研究CRO

2015年至2021年，全球抗衰老市场规模从1395亿美元增长至2160亿美元，增长了765亿美元，同比增长率达11.1%。中国抗衰市场也在明显扩容，2021年中国女性“抗衰”搜索频率达到300亿次，国内用户对于抗衰老产品需求强烈。

随着抗衰赛道火热，抗衰管理条例却在逐渐收严，在产品功效的宣称上概念不可模糊。根据《化妆品功效宣称评价规范》，对产品功能进行宣称前需要进行化妆品检测，同时查阅《化妆品分类规则和分类目录》可以发现并无“抗衰老”“抗老”相关功效，因而在功效宣称上可在抗衰类目下进行细分功效评价试验。

数据来源：公开资料整理

01、基于衰老的产生过程和机制，建立微观指标抗衰功效评价模型

衰老是一个持续变化的生命过程，既涉及到分子生物学层面的变化（基因、蛋白、脂肪等），也涉及到细胞层面的变化（细胞结构、细胞功能），最终体现为一些宏观的现象，比如皮肤出现皱纹、失去弹性、缺乏光泽、出现褐斑等等。

化妆品功效评价法规中所定义的化妆品功效，比如“抗皱”、“紧致”等都是指对皮肤宏观表象的改善作用。人体功效实验基本上以宏观现象指标为主，而斑马鱼实验结合衰老产生过程和机制，既可以开展宏观指标评价，也可以开展微观指标功效研究。

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环特生物通过对衰老过程和原因的研究，结合基因编辑技术，建立了成熟的斑马鱼抗衰老微观指标评价模型，如：β-半乳糖苷酶活性增高（在衰老的细胞中活性升高，是衰老细胞最常用的标志物之一）、活性氧积聚、胶原蛋白与弹性蛋白流失、基质金属酶上调、MAPK 和 cAMP 途径激活等等，为化妆品抗衰功效提供基础研究数据和相关指标的支撑材料。

①Ⅰ型胶原蛋白基因、弹性蛋白基因相对表达量

皮肤皱纹的出现与胶原蛋白的正常合成和表达密切相关。弹性蛋白与胶原蛋白共同存在于胞外基质，对于皮肤弹性的维系起着重要作用，其表达量的下降是皮肤超声皱纹、松弛、下垂等老化现象的主要原因。斑马鱼具有与人高度保守的调控胶原蛋白的相关基因。通过检测斑马鱼胶原蛋白相关基因的相对表达量可以反映护肤产品的抗皱功效，通过检测斑马鱼弹性蛋白相关基因的相对表达量可以反映护肤产品的紧致功效。

②ROS清除作用、SOD含量、GSH含量

活性氧（ROS）是含氧的化学反应性化学物质，其在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用。然而在紫外线暴露期间，ROS 水平会急剧增加。这可能会对细胞结构造成严重损害，这被称为氧化应激。当自由基产生量大于机体清除能力时就发生氧化应激反应。氧化应激时超氧化物歧化酶( Superoxide dismutase，SOD) 活性降低，产生过多的脂质过氧化产物丙二醛( Malondialdehyde，MDA) ，谷胱甘肽过氧化物酶( Glutathione peroxidase，GSH-Px) 是体内重要过氧化物分解酶，能使过氧化物 MDA 还原，保护细胞免受氧化损伤。因此SOD、MDA、GSH-PX 作为判断氧化应激程度的重要指标。

图注：卵黄囊ROS荧光强度减少，具有抗氧化功效

③β-半乳糖苷酶活性抑制作用

β-半乳糖昔酶活性的升高与活性氧的过量积聚是细胞衰老的显著特征。X-Gal是B-半乳糖甘酶的显色底物，B-半乳糖昔酶可将其切割，生成不溶的蓝色化合物，该蓝色化合物的含量即可表征B-半乳糖昔酶的活性。

将发育早期全身透明的斑马鱼为试验动物，利用半乳糖苷酶试剂盒进行染色处理，根据染色强度进行活性定量，进而对化妆品的抗衰老功效进行评价。

图注：颜色越深，β-半乳糖苷酶表达越多，衰老越严重

④端粒酶活性

衰老与端粒酶活性相关。端粒有重要的生物学功能，随着年龄的增长，端粒 DNA 在体细胞分裂过程中自然缩短，当端粒长度变得非常短时，端粒功能受损，导致基因组不稳定、细胞衰老和凋亡。体细胞端粒会随着年龄的增长而逐渐缩短，此时端粒酶会起到延缓端粒缩短的作用，端粒酶活性降低则端粒缩短。可以通过检测端粒酶活性是否增强来判断供试品的抗衰老功效。

⑤改善循环-血流速度

衰老与代谢缓慢相关，皮肤微循环可以反映代谢的快慢。皮肤微循环减弱，将导致代谢能力下降、细胞供应不足，出现色素沉着、暗黄早衰等。因此，改善皮肤微循环是抗初老的重要途径。通过观察斑马鱼血流速度的变化量评价微循环的改善作用。

02、深入探索衰老相关因子，利用基因编辑技术建立抗衰评价新方法

1980年Mique和Cowiker提出线粒体DNA损伤学说。该学说认为，线粒体DNA损伤是细胞衰老及死亡的分子基础。线粒体的破裂、变性、渗漏等都是衰老产生的重要原因。因此延缓或改善受损线粒体，可起到延长细胞寿命、延缓衰老的作用。

①增强线粒体功效评价

环特生物独家自研线粒体荧光标记转基因斑马鱼，诱导建立线粒体损伤模型，通过对比斑马鱼身体肌肉线粒体荧光强度，评价样品是否具有增强线粒体功效。

线粒体荧光品系斑马鱼荧光强弱与线粒体数量相关，氯化钴诱导缺氧和缺氧损伤，影响线粒体呼吸链正常功能，最终导致线粒体自噬功能被激活，受损线粒体被体内的溶酶体选择性的清除，从而影响了斑马鱼体内线粒体的正常数量，使线粒体荧光强度降低。给予供试样品后，分析斑马鱼身体肌肉线粒体荧光强度，判断其是否具有增强线粒体功效。该方法可适用于化妆品及其原料的增强线粒体功效评价。

图注：增强线粒体典型图（黄色虚线部位为定量区域）

②促进自噬功能

细胞自噬是真核细胞中普遍存在的一种自我保护机制，细胞存在老化受损的细胞器、错误合成的蛋白质、入侵细胞的细菌以及大分子物质等，细胞自噬通过形成自噬体包裹这些对细胞有害的物质，并与溶酶体结合形成自噬溶酶体来分解、清除这些物质，保持细胞内环境稳态以及细胞内物质的循环利用。

环特生物利用领先的基因编辑技术，自主开发EGFP-Lc3转基因斑马鱼，其胚胎具有半透明的特性，可在活体状态下使用共聚焦荧光显微镜观测到Lc3蛋白发出特异性绿色荧光。在正常情况下，Lc3蛋白分布于整个细胞质中，荧光信号呈弥散状；自噬被诱导启动后，Lc3蛋白会聚集到自噬小体膜上，荧光信号变为点状且高亮。通过检测斑马鱼单位面积肝脏自噬小体数量可评价样品是否具有促进自噬功效。

图注：白色虚线部位为定量区域，箭头所指为肝脏自噬小体

03、总结  

随着人均生活水平的提高，人们对美好生活的更高追求，女性对皮肤保养问题越来越看重。在市场需求的推动下，化妆品越来越注重抗衰老的功效。在科学技术不断发展的当下，抗衰产品的功效评价方法也在不断推成出新，评价方法朝着更简单、客观、直观、易于操作的方向发展。

本文评价方案所涉及斑马鱼品系为：野生型AB品系，黑色素等位基因突变斑马鱼（Albino）、转基因线粒体绿色荧光斑马鱼（CZ222）、Tg(fabp10a:EGFP-Lc3)品系斑马鱼等。其中转基因线粒体绿色荧光斑马鱼（CZ222）、Tg(fabp10a:EGFP-Lc3)品系斑马鱼为环特最新开发自研的斑马鱼品系。与以往评价方法相比，新品系斑马鱼可以通过观察受试组的荧光强度及自噬小体的数量评价功效效果，使评价方法更简单、实验结果更直观。

环特生物将基于斑马鱼抗衰老模型，持续深入地探索衰老相关因子，不断完善现有的功效方法、开发新的评价方法，为抗衰化妆品提供科学支撑的同时，也能够进一步助力抗衰化妆品的研发及升级，促进化妆品产业发展。

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参考文献：

[1]董银卯,孟宏,易帆编著.皮肤本态研究与应用,化学工业出版社,2019.7

[2]Cui Jianzhou,Sim Tina HueyFen,Gong Zhiyuan,Shen HanMing. Generation of transgenic zebrafish with liver-specific expression of EGFP-Lc3: a new in vivo model for investigation of liver autophagy.[J]. Biochemical and biophysical research communications,2012,422(2).

[3]王彩霞,中国女性皮肤衰老与生理参数及皮肤微生物的关系研究,上海应用技术大学,2022.

[4]数据来源：Research and Markets，Zion Market Research，艾媒数据中心《2022-2023年全球与中国抗衰老行业发展及消费者需求研究报告》