临床前研究|益生菌降低斑马鱼焦虑的相关行为

核心摘要 

越来越多的证据表明肠道微生物组可能对神经系统过程和行为产生影响。在这项研究中，我们使用新型水箱试验（NTT）来分析斑马鱼在补充具有探测到的抗氧化剂和抗炎特性的益生菌4个月后的探索行为。结果表明，长期摄入鼠李糖乳杆菌CECT8361和长双歧杆菌CECT7347会明显改变斑马鱼模型的游泳方式和平均游泳速度。经过处理后，斑马鱼放到新的水箱中后，极大地降低了其缸底行为，这可能与焦虑程度较低有关。

文｜大卫·G·瓦尔卡塞，胡安·M. ·马丁内斯-巴斯克斯，Marta F. Riesco，Vanesa Robles

文章发表于《Heliyon》 6（2020）e03973

（本文在翻译中做了部分节选）

一、综述

益生菌的使用不断增加，拓宽了我们对肠道微生物组和细菌代谢物的组成通过不同的调节途径对神经和行为过程的相关影响的认识。近年来，大多数研究都集中在人类或其他哺乳动物上，然而，使用斑马鱼模式生物已比较常见。这是因为，它们很容易人工饲养繁殖，并且它们的一些神经通路与哺乳动物的神经通路具有高度同源性。

斑马鱼（Danio rerio）作为一种模式生物，其益生菌实验的结果可以用作人类治疗的参考，因为它们具有相似的肠道微生物群和定殖模式。新型水箱试验（NTT），是用来测试斑马鱼焦虑相关行为的广泛使用的实验程序之一，这是基于它们自然的偏好，即首次将其放置在新型水箱中时会在底部附近游泳。人们通常认为鱼离开鱼缸底部并开始探索其他区域之前，斑马鱼所花费的时间差异反映了它们所经历的焦虑。多项研究使用这种方法分析了不同物质对鱼类生长的影响，观察到与地西epa，丁螺环酮等抗焦虑药和氟西汀等呈正相关。然而，尚未深入研究益生菌摄入对行为反应的附带影响，在某些情况下对压力的反应有所降低，而在其他情况下则没有直接的相关性。因此，触发此响应的机制仍不清楚。

在本研究中，我们分析了给予鼠李糖乳杆菌CECT8361和长双歧杆菌CECT7347菌株的益生菌混合物（1：1）的斑马鱼成鱼的探索行为如何受到影响，这已经证明它们对改善人类和斑马鱼的生精性能方面的作用。

二、实验方法及新型水箱测试：

这项研究使用了两组成年野生斑马鱼（AB品系）。将所有鱼饲养在3升的水箱中，并从配备有机械、化学和生物过滤器的再循环系统交换恒定的水。将水保持在26°C的平均温度，房间以14/10的明暗周期进行。

为了评估益生菌施用对鱼类行为的影响，为每个组提供了4个月（2018年12月至2019年3月）的不同喂养方式。在行为测试前一个月，将每只鱼在110 mg / L的三卡因甲磺酸缓冲液（MS222）中进行麻醉，并分别用可见的植入弹性体进行标记（Northwest Marine Technology，WA，USA）。在实验期间，CTRL的一条鱼死亡。

将四边形玻璃水族箱（20×8×18 cm；长×宽×深）填充至总体积为3.5 L，并将其用作评估场所。使用网将每条鱼分别放置在水箱底部，并记录其游泳行为（1920×1080 px），持续6分钟。试验结束后，将鱼与不同组的幼稚鱼分开转移到回收池中。使用NoldusEthovision®跟踪软件分析了视频文件，生成了一个虚拟网格，将储罐在上下区域的一半深度处分开。确定每个区域所花费的时间（以占总时间的百分比表示），区域之间的穿越次数、平均速度、移动的总距离以及头一次穿越上方区域的等待时间。

三、实验结果：

当将鱼放置在新的环境中时，其本能会在水柱底部引发保护性潜水行为，从而降低了被更接近水面的潜在捕食者袭击的风险。

新型水箱试验（NTT）是基于此响应在斑马鱼行为实验中常用的测试。该测定法可以被定义为啮齿动物开放视野范例的类似物。因此，由于NTT在“安全”潜水行为与“探索”游泳行为之间存在冲突，因此可以研究在特定实验条件下鱼的趋地逃逸潜水本能的强度。

在正常受控的实验室条件下，斑马鱼通常在监测的前几分钟倾向于在水箱底部花费更多的时间，显示出较高的不稳定运动和不动事件发生率。适应期过后，斑马鱼逐渐探索水柱的上部。我们的结果表明，成年斑马鱼以抗氧化剂和抗炎混合物的益生菌菌株为食（图1A）持续四个月，与对照喂养的鱼相比，表现出强烈改变的行为模式。

使用Ethovision软件，我们创建了两个同构的虚拟子区域（图1 B），目的是分析探索模式（行为的时空动态）。

我们的结果显示，在新型水箱测试中，虚拟产生的游泳区域（上下）的偏好性有统计学显着差异（p = 0.0137；t = 2.790）。益生菌喂养的动物在分析热图时表现出对上部区域的总体强烈偏好（图 1）。C和1D）。

图1  鼠李糖乳杆菌CECT8361和长双歧杆菌CECT7347的摄入可调节4个月后斑马鱼的行为。（一）实验设计的示意图。（B）新型水箱试验（NTT）和已建立的分析区域的示意图。（C）在两个实验组（CONTROL和PROBIO）的轨迹进行Ethovision分析后获得的热图。

另一方面，标准喂养的动物对表面没有这种偏爱。实际上，与CTRL记录的平均值（40±13.2％）相比，PROBIO组在较高区域中获得的时间百分比的平均值（80±6.5％）。在对照组中，只有50％的受研究鱼类表现出对上部区域的偏爱，而88.89％的益生菌喂养的动物更喜欢靠近水面。实际上，PROBIO组中的9条鱼中有7条在上分区花费了80％的6分钟新颖水箱测试实验。

我们还评估了速度，每只动物的总游走距离（图1 E），分区之间的过渡次数（图1 F）和头一次穿越的潜伏期（图1）。G）。统计分析仅记录了平均速度（图1 E）的显着差异（p = 0.0158；t = 2.719 ）。

在我们的实验中，与益生菌喂养的鱼兄弟姐妹（4.2±0.3 cm / s）相比，CTRL显示出更高的速度（6±0.5 cm / s）。进入PROBIO组的上部分区的潜伏期令人惊讶地低（直到头一次探索上部区域，没有一条鱼持续超过10 s）（图1 H）。

图1  鼠李糖乳杆菌CECT8361和长双歧杆菌CECT7347的摄入可调节4个月后斑马鱼的行为。柱状图和点状图显示：（D）动物在上部区域所花费的时间（％）；（E）平均速度（cm / s）; （F）总距离（厘米）；（G）过线点（n。）和（H）到头一个过境点的延迟时间。数据以平均值±标准误差表示。星号显示出统计学上的显着差异*（p <0.050）。

这些数据令人关注，因为它们结合了明确的空间偏好；它们表明群体之间的行为模式存在明显差异。压力可以调节斑马鱼的NTT模式行为。一些通常用于治疗人类焦虑症的抗焦虑药，例如丁螺环酮和地西epa或慢性氟西汀，往往会增加斑马鱼在实验设备顶部花费的时间。

这些与我们的结果的相似性表明，益生菌混合物可能对模型动物的焦虑调节有影响。进一步的研究可以解决抗焦虑控制的纳入和菌株定植的证明。但是，我们认为在4个月内持续进食可以确保肠道中细菌及其代谢物的持续存在。

总之，我们已经确定，鼠李糖乳杆菌CECT8361和长双歧杆菌CECT7347的长期摄入（4个月）会改变斑马鱼模型中的游泳方式。我们的研究结果表明，成年斑马鱼饲喂这种已批准供人类食用的抗氧化剂和消炎益生菌菌株的益生菌混合物，可将其放置在新的水箱中，从而大大降低斑马鱼的底栖测地行为。这种主要的行为反应与较低的焦虑状态相关。因此，摄入这种益生菌混合物可以被认为是治疗焦虑症的有益方法。

参考资料：

[1] Bass, S.L.S., Gerlai, R., 2008. Zebrafifish (Danio rerio) responds differentially to stimulusfifish: the effects of sympatric and allopatric predators and harmless fifish. Behav. BrainRes. 186 (1), 107–117.

span style="font-size: 14px;">[2] Bencan, Z., Sledge, D., Levin, E.D., 2009. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepameffects in a zebrafifish model of anxiety. Pharmacol. Biochem. Behav. 94 (1), 75–80.

[3] Cachat, J., Stewart, A., Grossman, L., Gaikwad, S., Kadri, F., Chung, K.M., et al., 2010.Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafifish.Nat. Protoc. 5 (11), 1786–1799.