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斑马鱼实验模型
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利用斑马鱼模型评价肺炎防治作用

【评价原理】

斑马鱼的鳔从器官进化、组织结构以及生物学等多个层面都类似于哺乳动物的肺泡。我们与浙江大学公共卫生学院从事慢阻肺研究的团队合作,进行鱼鳔损伤模型与肺损伤相关性研究。我们发现细微颗粒、细菌、肿瘤细胞以及肺炎患者的灌洗液都会引起斑马鱼鳔损伤,产生严重的炎症反应,甚至导致斑马鱼鳔破裂。通过我们所做的机制方面的研究及实验证明,斑马鱼模型可以作为急性肺损伤研究的新模型,进而可以用于肺损伤治疗或者预防的有关药物的筛选。

(1)细菌性肺炎:注射给予LPS建立斑马鱼肺炎模型。LPS是脂质和多糖的复合物,来源于革兰氏阴性菌细胞壁的外膜,是内毒素的主要成分。接触一定量的LPS会引起机体支气管炎、肺炎、肝炎及脂多糖血症。

(2)病毒性肺炎:注射给予聚肌胞——poly(i:c)建立斑马鱼肺炎模型。poly(i:c)的双链RNA结构非常类似于病毒或病毒复制过程中形成的双链RNA,所以poly(i:c)类似某些病毒,具有很强的干扰素诱生作用。

通过使用转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼,在荧光显微镜下可以直接观察斑马鱼中性粒细胞,使用实时荧光定量PCR仪可获得基因表达水平,通过制作组织病理切片观察斑马鱼鱼鳔部位的病理结构变化。

【实验方案】

(1)我们将受测试斑马鱼分成三组,分别是正常对照组、模型对照组和抗肺炎药物组。其中,模型对照组与抗肺炎药物都注射了等量的LPS建立肺炎模型。抗肺炎药物在注射了LPS的同时摄入吲哚美辛之类的抗肺炎药物。

(2)我们将受测试斑马鱼分成三组,分别是正常对照组、模型对照组和抗肺炎药物组。其中,模型对照组与抗肺炎药物都注射了等量的聚肌胞——poly(i:c)建立肺炎模型。抗肺炎药物在注射了poly(i:c)的同时摄入吲哚美辛之类的抗肺炎药物。

服用一段时间抗肺炎药物后,我们在荧光显微镜下拍摄斑马鱼中性粒细胞,用实时荧光定量PCR仪检测TNF-α、IL-1β值,同时制作成病理切片观察鱼鳔部位的病理结构变化。

【结果展示】

斑马鱼中性粒表型图

图1. 斑马鱼中性粒表型图

黄色虚线区域为鱼鳔,绿色荧光颗粒为中性粒细胞

可以看到,服用抗肺炎药物组斑马鱼鱼鳔位置处的中性粒细胞与正常对照组相似,未出现模型对照组中性粒细胞明显增多的情况。

TNF-α、IL-1β基因表达水平

图2. TNF-α、IL-1β基因表达水平

与模型对照组比较,***p < 0.001

可以看到,服用抗肺炎药物组斑马鱼的炎症基因表达水平与正常对照组较为接近,未出现模型对照组炎症基因的表达水平明显升高的情况。

鱼鳔部位病理切片

图3. 鱼鳔部位病理切片

从病理切片中也能看出来,服用抗肺炎药物组斑马鱼鱼鳔病理结构与正常对照组相似,未出现模型对照组渗入的中性粒细胞数的情况。

【评价结论】

1.经过每组30尾斑马鱼的对比实验,服用抗肺炎药物在中性粒细胞、炎症基因表达和病理结构均与正常对照组相似,未出现模型对照组的中性粒细胞数显著增加炎症基因表达水平明显升高和病理出现中性粒细胞渗出的情况。

2.本实验证实了吲哚美辛具有显著的防治肺炎作用。